Sekuencat gjenomike të shumicës së viruseve janë të njohura.Sondat e acidit nukleik, të cilat janë segmente të shkurtra të ADN-së, të krijuara për t'u hibridizuar me segmente të ADN-së ose ARN-së virale plotësuese.Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një teknikë më efikase për zbulimin e viruseve.Kohët e fundit janë zhvilluar metoda të diagnostikimit me kapacitet të lartë.
A. Teknika e hibridizimit të acidit nukleik
Hibridizimi i acidit nukleik, kryesisht duke përfshirë Southern blotting (Southern) dhe Northern blotting (Northern), është një teknikë e re me zhvillim të shpejtë në fushën e diagnostikimit të virusit.Arsyeja e analizës së hibridizimit është përdorimi i segmenteve të shkurtra të ADN-së (të quajtura "sondë") të krijuara për t'u hibridizuar me segmente të ADN-së ose ARN-së virale plotësuese.Me ngrohje ose trajtim alkalik, ADN-ja ose ARN-ja e synuar me dy vargje ndahen në fije të vetme dhe më pas imobilizohen në një mbështetje të fortë.Pas kësaj, sonda shtohet dhe hibridizohet me ADN-në ose ARN-në e synuar.Meqenëse sonda është etiketuar me izotop ose me nukleide jo radioaktive, ADN-ja ose ARN-ja e synuar mund të zbulohet nëpërmjet autoradiografisë ose nga sistemi biotin-avidin.Meqenëse shumica e gjenomave virale janë klonuar dhe sekuencuar, ato mund të zbulohen duke përdorur sekuenca specifike të virusit si sonda në ekzemplar.Aktualisht, metodat e hibridizimit përfshijnë: dot blot, hibridizimin in situ në qeliza, blotting ADN (ADN) (Southern blot) dhe ARN blotting (ARN) (Northern blot).
Teknologjia B.PCR
Vitet e fundit, janë zhvilluar një sërë teknikash in vitro të amplifikimit të acidit nukleik bazuar në PCR, për të testuar viruse të pandjeshëm ose të pa kultivueshëm.PCR është një metodë e cila mund të sintetizojë sekuencën specifike të ADN-së me reaksion in vitro të polimerazës.Procesi i PCR përfshin një cikël termik prej tre hapash: denatyrim, pjekje dhe shtrirje Në temperaturë të lartë (93℃~95℃), ADN-ja me dy vargje ndahet në dy vargje të vetme të ADN-së;më pas në temperaturë të ulët (37℃~60℃), dy abetare nukleotide të sintetizuara kalojnë në segmentet plotësuese të ADN-së;ndërsa në temperaturën e duhur për enzimën Taq (72℃), sinteza e zinxhirëve të rinj të ADN-së fillon nga fundi i primerit 3' duke përdorur ADN plotësuese si shabllone dhe nukleotide të vetme si materiale.Pra, pas çdo cikli, një zinxhir i ADN-së mund të përforcohet në dy zinxhirë.Duke përsëritur këtë proces, çdo zinxhir i ADN-së i sintetizuar në një cikël mund të përdoret si shabllon në ciklin tjetër, dhe numri i zinxhirëve të ADN-së dyfishohet në çdo cikël, që do të thotë se prodhimi i PCR përforcohet në një shpejtësi log 2n.Pas 25 deri në 30 cikle, prodhimi i PCR identifikohet përmes elektroforezës dhe produktet specifike të ADN-së mund të vëzhgohen nën dritën UV (254 nm).Për avantazhin e specifikës, ndjeshmërisë dhe komoditetit, PCR është miratuar në diagnostikimin klinik të shumë infeksioneve virale si HCV, HIV, CMV dhe HPV.Meqenëse PCR është shumë e ndjeshme, ajo mund të zbulojë ADN-në e virusit në nivel fg, operacioni duhet të kryhet me shumë kujdes për të shmangur pozitivitetin e rremë.Për më tepër, rezultati pozitiv në testin e acidit nukleik nuk do të thotë se ka virus infektiv të gjallë në mostër.
Me aplikimin e gjerë të teknikës PCR, teknikat dhe metodat e reja zhvillohen bazuar në teknikën PCR për qëllime të ndryshme testimi.Për shembull, PCR sasiore në kohë reale mund të zbulojë ngarkesën virale;in situ PCR përdoret për të identifikuar infeksionin e virusit në inde ose qeliza;PCR e vendosur mund të rrisë specifikën e PCR.Midis tyre, PCR sasiore në kohë reale është zhvilluar më shpejt.Shumë teknika të reja, si sonda e hidrolizës TaqMan, sonda e hibridizimit dhe sonda molekulare e fenerit, janë kombinuar në teknikën sasiore PCR në kohë reale, e cila përdoret gjerësisht në kërkimet klinike.Përveç identifikimit të saktë të ngarkesës virale në lëngjet trupore të pacientëve, kjo metodë mund të përdoret gjithashtu për të zbuluar mutantin tolerant ndaj ilaçeve.Prandaj, PCR sasiore në kohë reale përdoret kryesisht në vlerësimin e efektit kurativ dhe mbikëqyrjen e tolerancës së barnave.
C. Zbulimi me fuqi të lartë të acideve nukleike virale
Për të plotësuar nevojat për diagnostikim të shpejtë të sëmundjeve të reja infektive emergjente, janë krijuar metoda të ndryshme të zbulimit me performancë të lartë, si çipat e ADN-së (ADN).Për çipat e ADN-së, sondat specifike sintetizohen dhe bashkohen me çipa të vegjël silikoni me densitet shumë të lartë për të formuar mikrogrumbullimin e sondës së ADN-së (ADN) e cila mund të hibridizohet me mostrën.Sinjali i hibridizimit mund të imazhohet me mikroskop konfokal ose skaner lazer dhe të përpunohet më tej nga kompjuteri dhe mund të merret një grup i madh i të dhënave në lidhje me gjene të ndryshme.Ekzistojnë dy lloje të çipit të ADN-së."Çipi i sintezës" është si më poshtë: oligonukleotidet specifike sintetizohen drejtpërdrejt në çipa.Një tjetër është çipi i grupit të ADN-së.Gjenet e klonuara ose produktet PCR janë të shtypura në mënyrë të rregullt në rrëshqitje.Avantazhi i teknologjisë së çipit të ADN-së është zbulimi i njëkohshëm i një sasie të madhe të sekuencave të ADN-së.Versioni më i fundit i çipit të zbulimit të patogjenit mund të identifikojë mbi 1700 viruse njerëzore në të njëjtën kohë.Teknologjia e çipit të ADN-së zgjidhi problemet e metodave tradicionale të hibridizimit të acidit nukleik dhe ka aplikime shumë të gjera në diagnostikimin viral dhe studimin epidemiologjik.
Koha e postimit: Dhjetor-23-2020